脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一种以脊髓前角及α运动神经元退行性变为主，全身多系统受累的、高致死和高致残率的遗传性神经-肌肉罕见病[1]。脊髓性肌萎缩症典型临床特征是以肢体近端和躯干进行性、对称性肌肉无力和萎缩为特点，随着疾病进展常累及多系统，最终可导致患儿早期死亡。
95％以上的SMA是由遗传导致的SMN1纯合缺失或突变引起的（图1）。SMN1的缺失或突变导致患者只能依赖SMN2来生产必须的SMN蛋白[2]。与其他组织相比，运动神经元中SMN的表达水平通常更高[3]，SMN蛋白的缺乏不利于运动神经元的发育存活，从而导致肌无力和肌萎缩，严重时会累及骨骼肌、呼吸肌、消化道平滑肌等肌肉，进一步使得骨骼系统、呼吸系统及消化系统等产生异常，导致SMA发生发展，危及生命。
图1. 脊髓性肌萎缩症发病原理
临床依据发病年龄和最大运动能力将SMA分为五种表型，并依据不同表型选择不同治疗方式。目前认为疾病的严重程度主要与SMN2拷贝数有关，拷贝数的增加使完整SMN蛋白的数量增多，这有利于运动神经元的发育存活，因此，SMA随基因拷贝数的减少而加重（表1）。
表1. 脊髓性肌萎缩症的不同表型
针对该疾病，目前国际上比较通用的药物共有三种，均为靶向SMN基因的治疗药物，分别为诺西那生钠、索伐瑞韦和利司扑兰。本文主要介绍诺西那生钠（nusinersen，spinraza）相关信息。
一、反义寡核苷酸药物诺西那生钠
反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）药物是一种治疗性RNA分子[4]，通过碱基配对特异性靶向RNA，可以诱导靶向蛋白质表达降低或恢复，与化合物相比具有更强的特异性，且由于其在基因水平上进行干预，所以对遗传性疾病提供了治疗选择[5]。寡核苷酸具有高靶标特异性，可获得以前无法获得的药物靶标，毒性更低且半衰期更长[6]。
诺西那生钠是反义寡核苷酸药物，这种药物通过干预SMN2剪切将外显子7纳入最终的mRNA转录本，增加完整SMN蛋白的含量。诺西那生钠注射液于2016年12月首次在美国获批，2019年4月在中国上市，是全球首个SMA精准靶向治疗药物。该药物经腰椎穿刺鞘内推注给药，这种给药方式使药物穿过血脑屏障，直接进入脊髓周围的脑脊液中发挥作用。由于药物在体内要经过装载再进行浓度维持，因此，该药品在第0天、第14天、第28天和第63天注射四次负荷剂量，此后每４个月进行一次维持剂量的注射[7]。
诺西那生钠作用机制是通过与SMN2基因内含子7剪接沉默子（intron splicing silencer,ISS）N1结合发挥作用。ISS-N1位于外显子7下游的5'剪接位点和内含子7的非保守部分，可募集hnRNP A1及hnRNP A2，被募集的hnRNP A1及hnRNP A2会不断积累蔓延至外显子7区域，阻止SR蛋白等促进外显子7识别与剪切的活性分子的结合，从而阻断外显子7的正常包涵。诺西那生钠通过碱基互补配对原则与ISS-N1杂交以阻断hnRNP募集，使得SMN2的pre-mRNA在剪切过程中包含外显子７，增加全长SMN蛋白的产生[6]（图2）。下文主要介绍诺西那生钠药学研究部分内容。
图2. 诺西那生钠治疗原理
脊髓性肌萎缩症治疗药物-诺西那生钠调研分析(上)文章中已详细介绍了诺西那生钠药学研究信息，那这篇文章将接着上篇文章，继续介绍诺西那生钠非临床与临床研究信息。
二、诺西那生钠非临床研究[8]
2.1. 药理学研究
诺西那生钠药理学研究列表如表2所示。
表 2 反义寡核苷酸注射液质量控制
体外试验表明，诺西那生钠（处理Hela细胞）通过其在染色质上合成时与SMN2前体mRNA上的靶点结合，导致外显子7包含增加；可使SMA患者成纤维细胞中的卡侯氏体二价染色体（gems）生成增加。
体内药理学研究选择的动物种属为转基因小鼠，因为人类是已知的唯一含有SMN2的物种。体内药理学研究显示诺西那生钠可诱导SMA小鼠模型的SMN2表达。在SMN2转基因小鼠（轻度SMA小鼠）模型中，本品可使SMN2剪接修正呈剂量依赖性增加，并观察到中枢神经系统（CNS）中药物水平与脊髓和脑中SMN2剪接修正水平之间有良好的相关性，具有PK/PD效应，脑室慢性输注较单次推注更有效，给药后作用持续长，与组织半衰期长有关。对C/C小鼠模型可使脊髓和脑中SMN2剪接修正呈剂量依赖性增加。药物在以上两个模型中显示了对SMN2的修正作用。
非临床药理学研究基本提示了诺西那生钠所提出的作用机制，与SMN2前体mRNA内含子区域结合，致使SMN蛋白表达增加；体内试验显示可使SMA模型小鼠SMN2剪接修正呈剂量依赖性增加。
安全药理学试验显示，大鼠鞘内给药连续25天未见对呼吸、血压、心率的影响；幼龄食蟹猴14周及53周重复给药毒性试验中未见对心血管系统的影响。
2.2 药代动力学研究
诺西那生钠进行了单独的猴多次鞘内注射的药代试验，其余猴单次给药毒性试验和幼龄猴重复给药毒性试验中伴随了毒代研究。药代动力学研究列表如表3所示。
表 3 反义寡核苷酸注射液质量控制
吸收：猴鞘内注射（IT）给药后，成年猴与幼龄猴间脑脊液（CSF）中的诺西那生钠药代动力学特征类似，诺西那生钠迅速分布于CSF中并被摄入CNS组织，之后通过CSF循环转移至体循环，IT给药后血浆药物浓度保持在远低于CSF浓度的水平。成年猴和幼龄猴间IT给药后的诺西那生钠CSF终末消除半衰期（t1/2）估测值一致，观测值为102-111天。成年猴和幼年猴中转移至体循环后，血浆中诺西那生钠的浓度于IT推注后2-5小时达到峰值，之后在给药后的前24-48小时期间迅速下降，紧接着为缓慢的消除期。血浆终末消除半衰期估测值（35-56天）低CSF中估测值（102-111天）。
分布：成年猴和幼龄猴中诺西那生钠的剂量依赖性组织分布类似，表现为诺西那生钠在IT给药后广泛分布至CNS组织，在腰部脊髓、大脑皮层和肝脏中出现最高浓度。在组织分布方面未见性别差异。在成年和幼龄猴中，诺西那生钠从CNS和全身组织中清除缓慢。成年猴和幼龄猴间的CNS组织终末消除半衰期（t1/2）中位估测值一致，观测值分别为116天（范围在74-275天之间）和174 天（范围在117-195天之间），这些结果与CSF中终末消除半衰期观测值（102-111天）类似。
诺西那生钠在体外与小鼠、猴、人全血浆蛋白高度结合（＞94%），从而降低了肾小球滤过率（限制了尿排泄），因此促进了分布至全身组织。诺西那生钠与猴和人的CSF蛋白结合程度低（5µg/mL时＜25%，150µg/mL时没有结合），这与CSF中存在的蛋白浓度较低相符。
代谢：多次IT给药后猴CSF、血浆和组织（腰部脊髓、大脑皮层、肝脏和肾脏）中的诺西那生钠及其相关代谢物的鉴定和特征分析显示完整诺西那生钠为检测到的最丰富的寡核苷酸，CSF中全为原形，血浆中＞95%，CNS和全身组织中 79%-81%。CSF、血浆和组织中观察到的代谢物均为短链寡核苷酸，提示此代谢主要通过核酸外切酶介导的缓慢水解作用完成。冷冻保存的人原代肝细胞的体外研究表明了诺西那生钠不是CYP450-介导的氧化代谢的诱导剂或抑制剂，因此应该不会与由该代谢途径介导的其他药物竞争。
排泄：未进行诺西那生钠的非临床尿排泄研究，已报道相似类别ASO在组织中的代谢为一个缓慢的过程，随后为主要代谢物（短链寡核苷酸）和少部分母体药物的尿排泄，预计诺西那生钠也出现类似过程。
2.3毒理学研究
诺西那生钠毒理学研究列表如表4所示。
表4 反义寡核苷酸注射液质量控制
种属选择：常用的毒理学研究种属仅有SMN1基因，因此不能在具有药理学活性种属中对诺西那生钠的潜在毒性进行评估，考虑到猴给药方式的适用性且猴在ASO药物组织分布、细胞摄取、代谢和毒性敏感性方面最具代表性，因此单次给药毒性/PK试验和核心的重复给药毒性试验（14周和53周）采用食蟹猴，且因为SMA主要为儿科病症，14和53周重复给药试验采用幼龄猴。
给药方式：核心重复给药毒性试验的给药途径为腰椎鞘内注射，与临床给药途径一致，小鼠和兔的生殖毒性试验使用皮下给药，以确保成年动物和胎仔的暴露。
猴单次给药和重复给药毒性试验中，对诺西那生钠的耐受性良好，除了最高剂量（单次给药试验中为7mg/次，14周试验中为3mg/次，53周试验中为4mg/次）出现急性短暂的低位脊髓反射缺失，对死亡率、体重、食量或一般观察结果没有影响。53周试验中未见对神经行为学或学习参数方面的治疗相关的影响或对幼年动物的生长或发育的影响，组织病理学观察到脑中海马空泡化增加，程度为轻微或轻度，部分动物在空泡化区域观察到神经元坏死或神经胶质细胞坏死，恢复期海马仍有空泡化，提示清除缓慢，结合神经学和体格检查，认为海马神经元中空泡形成与动物行为变化之间没有明显的关系。NOAEL确定为试验的高剂量。另对海马区空泡形成进行了追加研究，认为该空泡化与组织保留药物（寡核苷酸）有关，认为非不良影响。但是，监管单位审评认为，基于现有资料中海马空泡形成，并结合神经行为缺陷，可能应视为不良影响。
诺西那生钠还进行了幼龄CD小鼠重复给药13周毒性试验，NOAEL为50mg/kg/次。
遗传毒性：诺西那生钠Ames试验、体外CHO细胞染色体畸变试验、小鼠体内骨髓微核试验结果为阴性。
生殖毒性：诺西那生钠进行了CD-1小鼠生育力和胚胎发育试验（I+II段联合试验）、兔胚胎-胎仔发育毒性试验（II段试验）以CD-1小鼠围产期毒性试验（III段试验），未见对生育力、胚胎-胎仔发育及围产期发育的影响。
2.4反义寡核苷酸药物非临床研究考虑
目前针对寡核苷酸药物的非临床研究国内并未发布相关指导原则，由于其一般由化学合成而来，可参考化学药物非临床研究指导原则。除此之外国内2023年发布有一篇审评员文章《小核酸药物非临床特点和药理毒理评价策略》也可供参考，该文章内容总结如下表5、表6所示[9]。
表5 小核酸药物药效与药代研究建议
表6 小核酸安全性研究建议
三、诺西那生钠临床研究
支持诺西那生钠在FDA上市的临床试验数据主要包含一项I期临床试验、一项II期临床试验与两项III期临床试验，临床试验基本信息、试验设计与试验结果如下表7所示。ENDEAR试验[10]纳入了122例1型或2型SMA患儿，在最终分析中，诺西那生治疗组患儿产生运动里程碑应答比例、无进展生存期和总存活率均显著高于假治疗组。
此外，有研究发现与病程较长的患儿相比，筛查时病程较短的患儿更有可能从诺西那生钠中获益。CHERISH试验[11]在针对2型或3型SMA患儿的最终分析中发现，诺西那生钠组(84例)57%患儿的汉默史密斯运动功能扩展量表(Hammersmith Functional Motor Scale-Expanded，HFMSE)评分从基线至15个月至少增加3分，而对照组(42例)中该比例仅为26%。
表7 支持诺西那生钠上市的临床试验总结
诺西那生钠注射液于2019年2月获得中国药监局批准，注册分类为化学药品5.1类，纳入了优先审评审批程序。支持中国上市的临床试验数据为国外I-III期临床试验数据。并基于3项研究中的20名东亚受试者进行种族敏感性分析，总体来看东亚受试者与非东亚人群之间的所有血浆PK特征相似。在有限的数据内，疗效方面东亚受试者表现出与总体人群一致的趋势，安全性方面东亚受试者发生不良事件的类型与频率与非东亚受试者无明显的差异。因药物属于罕见病用药，且经研究认为不存在人种差异，诺西那生钠基于境外取得的临床试验数据直接获批上市。
展望
寡核苷酸药物具有特异性强、设计便捷、研发周期短、靶点丰富等优点，是当前生物医药领域研究的重点。同时递送技术的发展与创新不断促进核酸药物给药途径的进步。核酸药物递送平台（偶联递送系统、纳米颗粒载体等）的开发将推动递送技术和多种给药途径（如：皮下注射、静脉注射、雾化吸入、瘤内注射等）的共同发展。
未来，随着寡核苷酸药物的应用领域和技术领域不断突破创新，技术的更新将有助于寡核苷酸药物的发展。市场需求和市场规模将持续扩大，寡核苷酸药物的适应症范围广，包括肿瘤、罕见病、病毒性疾病、肾脏疾病、心血管疾病、炎症类疾病、代谢类疾病等。因此，寡核苷酸药物潜在适应人群基数大，随着技术的发展和生产的成熟，寡核苷酸药物市场在未来将有更广阔的发展空间。
参考文献
[1] Mercuri E, Bertini E, Iannaccone ST. Childhood spinal muscular atrophy: controversies and challenges[J]. Lancet Neurol, 2012, 11(5): 443-452
[2] KOLB S J, KISSEL J T. Spinal muscular atrophy[ J]Neurol Clin,2015,33(4):831 -846.
[3] ARNOLD W D,KASSAR D,KISSEL J T. Spinalmuscular atrophy :diagnosis and management in a newtherapeutic era[J].Muscle Nerve, 2015,51(2 )157 -167.
[4] KOLB S I,KISSEL IT. Spinal muscular atrophy[J]Neurol Clin,2015,33(4):831 -846.
[5] KUIPER EC,BERGSMA A J.PIINAPPEL WWMP,et al. Opportunities and challenges for antisense oli.gonucleotide therapies[J].Inherit etab Dis,2021.44(1):72-87
[6] LI Q.Nusinersen as a therapeutic agent for spinalmuscular atrophy[J].Yonsei Med J,2020,61(4):273 -283.
[7] MIGLIORATI J M,LIU S,LIU A,et al. Absorption.distribution, metabolism, and excretion of FDA-approved antisense oligonucleotide drugs[J]. DrugMetab Dispos,2022,50(6):888-897
[8] 诺西那生钠CDE审评报告
[9] 王恒,李华,汪溪洁,邱云良,汤纳平,黄芳华,常艳.小核酸药物非临床特点和药理毒理评价策略[J].中国新药杂志,2022,31(12):1137-1145.
[10] Finkel R, Farrar M, Vlodavets D, et al. FP . 24 RAINBOWFISH: Preliminary efficacy and safety data in risdiplam-treated infants with presymptomatic spinal muscular atrophy (SMA)[J]. Neuromuscul Dis, 2022, 32: S85-S86
[11] Mercuri E, Darras BT, Chiriboga CA, et al. Nusinersen versus Sham Control in Later-Onset Spinal Muscular Atrophy[J]. N Engl J Med, 2018, 378(7): 625-635
