目前，外科手术仍然是大多数实体肿瘤治愈的基础，在过去几十年中，即使使用了快速术中组织病理学评估，肿瘤总体阳性切缘率一直停滞在15%至60%。多种癌症（如头颈癌、脑癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和胃肠癌）的局部复发率增加和预后不良与阳性切缘有关[1]。
近年来，在精准外科理念的推动下，采用术中荧光造影剂（Fluorescent Contrast Agents）成像在外科学领域取得了显著的发展。术中荧光成像（Intraoperative fluorescence molecular imaging，FMI）技术具有指导外科手术的作用，为外科医师提供了实际可见的荧光显像。
在临床应用中，荧光造影剂能够清晰显示肿瘤轮廓，具有较高的识别度，实时引导手术过程。同时，它还可以定位淋巴结转移，发现微小转移病灶，并在术中识别重要的解剖结构，降低潜在的副损伤风险[2]。理想的外科手术引导技术应该具有灵敏度高、分辨率好、视野可调节、快速成像和无辐射的特点。开发新型、高效、安全的荧光造影剂成为当前医药研发领域的重要方向之一[3]。
一、荧光造影剂的技术优势[2]
荧光造影剂具有显著的技术优势，主要包括[4]：
1)实时监测：在手术流程中加入荧光引导不会破坏标准实践，术中荧光分子成像可以实时监测肿瘤组织的位置和边界，有利于降低手术培训的成本。肿瘤荧光剂的应用，改变了肿瘤外科的手术模式和理念。肿瘤荧光定位技术可以定位肿瘤、标记肿瘤边界，引导安全、最大限度地切除肿瘤，从而提高肿瘤全切率和神经血管保护率，延长无进展生存期。
2)灵敏度高：该技术对肿瘤组织的检测灵敏度极高，可达到亚细胞水平，与CT、MRI、PET或超声检查相比，FMI可以达到皮摩尔级灵敏度和微米级空间分辨率，并且可以每秒采集数百帧图像。
3)特异性高：荧光信号仅在肿瘤组织中显示，减少对正常组织的损伤。
4)安全性高、操作方便：与放射性体内诊断药物相比，无电离辐射，避免辐射暴露造成的危害如细胞损伤、形成恶性肿瘤和基因突变、放射性污染，不需要采取特殊的防护。放射性体内诊断药物依赖核医学设备成像，操作过程复杂；小巧的荧光成像仪可以方便地在手术使用，并方便搬运。
二、荧光造影剂的发展
图1 术中荧光成像的发展[5]
荧光素自十九世纪中叶被发现以来，吲哚菁绿（ICG）成为首个获得FDA批准的荧光染料。随之，一系列成像系统的获批为设备的开发奠定了基础，而不断累积的临床经验也使得FDA对术中使用荧光剂的批准变得水到渠成。
2017年，FDA批准5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）用于胶质瘤的治疗；
2018年，氨基酮戊酸己酯（hexaminolevulinate）获准用于膀胱癌的诊断[6]；
2021年，靶向荧光造影剂Cytalux（pafolacianine，OTL38）被批准用于卵巢癌手术。
自此，荧光技术在医学和外科手术领域的应用呈现出指数级增长，对外科手术的临床实践产生了深远影响[5]。
三、经典荧光造影剂
已批准用于临床的经典荧光造影剂，对于肿瘤没有特异性，因此不是最理想的造影剂，但它们是目前荧光引导手术领域的常见选择，以下为几种经典荧光造影剂。
1)吲哚菁绿（ICG）[7]已获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧盟食品药品监督管理局（CE）批准的知名近红外有机染料。通过静脉注射或直接注入患者体内，在世界范围内被广泛应用于乳腺癌患者的血管造影、活检引导、血流评估、肝功能评估以及淋巴结绘图中的光学成像。
ICG是一种近红外荧光染料，可被波长范围在750～810 nm的光所激发，发射波长840 nm左右的近红外光，其增强荧光的组织穿透深度范围在0.5～1.0 cm之间。基本不可能对血液主要成分（血红蛋白和水）可能产生的自发荧光发生干扰效应。
ICG相对无毒副反应，在血液中的半衰期约为4 min，通过肝脏代谢排泄至胆管，无肾毒性。ICG在1957年即进入临床试验，作为成像介质已经在临床使用超过50年。报道的不良反应发生率＜0.01％。ICG可引起过敏休克样症状，不完全溶解时可能发生恶心、发热、休克等反应[8]。
2)5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是一种氨基酸（小的亲脂性两性离子），在美国、欧洲、加拿大与日本等地已被批准应用于胶质母细胞瘤的光动力诊断。在高代谢活性细胞中，5-ALA 经血红素合成途径转化为大量原卟啉IX，其荧光特性表现为405nm的吸收峰与635nm的红色可见光发射峰，实现组织表面及2毫米深度内的荧光成像。然而5-ALA在超过2毫米厚的病变组织中的渗透能力受限，进而可能影响治疗效果[9-11]。
3)己氨基乙酰丙酸酯（Hexyl-aminolevulinate, HAL, Hexvix/Cysview®），是一种血红素前体5-氨基乙酰丙酸的亲脂性酯，术前灌注入膀胱，被肿瘤细胞代谢为原卟啉 IX，在蓝光（380-470 nm）下显示红色荧光，所以又称为蓝光膀胱镜（BLC）。
最初于2010年获得美国食品和药物管理局批准，用于非肌层浸润膀胱癌NMIBC患者病变的检测。2018年扩大了其适应症，纳入原位癌（CIS）诊断及蓝光柔性膀胱镜和术后监测应用[12]。美国泌尿科协会和泌尿科肿瘤学会推荐蓝光膀胱镜检查，以提高NMIBC的检出率并减少复发[13, 14]。荟萃分析提示，HAL与白光镜相比，在NMIBC（特别是原位癌CIS）的检测敏感性更高（对于Ta期NMIBC，比白光膀胱镜WLC多检测出14.7%病灶；对于CIS期NMIBC，BLC比WLC多检测出40.8%病灶）。25%的患者通过BLC检测到了额外的Ta/T1期肿瘤。此外，BLC疗法12个月复发率相较于WLC对照组显著降低（34.5% vs 45.4% [RR]，0.761 p<0.05），24个月复发率（RR 0.75，95% CI：0.62-0.91）。然而与白光膀胱镜检查相比，HAL的假阳性率较高（43%至82%[15]），而且BLC对晚期复发率、进展率的影响尚未得到充分论证[16, 17]。
四、新型靶向荧光造影剂
靶向荧光显影剂通常是由荧光染料和靶向分子两部分组成[18]。
1）荧光染料：能够发出特定波长的荧光信号，包括花青类Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5；近红外染料：如IRDve800CW；纳米颗粒；可见光谱染料。
2）靶向分子则能够与特定的生物分子或细胞受体结合，从而实现对目标组织的定位，包括抗体、适配体、肽、小分子。
目前上市的诊断用靶向荧光造影剂仅有Cytalux®（Pafolacianine，OTL38）。
OTL38是一种叶酸类似物与吲哚菁绿相关的荧光染料SO456偶联合成的叶酸受体靶向荧光造影剂；吸收光范围760~785nm，吸收峰为776nm，发射荧光范围790~815nm，发射峰为796nm[18]。
2021年11月，FDA批准OTL38用于成年卵巢癌患者。2022年12月，FDA批准OTL38用于成年肺癌患者，作为术中识别恶性病变的辅助手段[19, 20]。其随机、多中心、开放III期临床研究（NCT03180307）评估了OTL38的安全性和有效性，共纳入178名疑似或确诊卵巢癌的女性患者，计划接受手术。134名患者接受了荧光成像和标准评估。结果显示，26.9%患者至少有一处额外癌症病变仅通过OTL38配合近红外荧光成像系统识别，而标准评估未能发现。同时，其假阳性率为20.2%[21]。
五、临床开发靶向荧光造影剂的相关考量
荧光造影剂属于医学影像学药物和生物制品（Medical Imaging Drug and Biological Products），还属于体内诊断试剂。多数情况下，荧光造影剂需要与特定的医疗设备联合使用，以适当的用法用量在设备工作参数条件下提供诊断信息。
2004年，美国食品药品监督管理局（FDA）颁布了三部指导原则，以指导医学影像学药物和生物制品（简称：医学影像学制剂）的研发。第一部涉及实施安全性评价[22]，第二部涵盖临床适应症[23]，第三部涉及临床研究的设计、分析及阐述[24]。2009年，欧洲药品管理局（EMA）亦发布了有关造影剂临床研究的技术指导原则[25]。
1)安全性评价（非临床和临床）
荧光造影剂属于非放射性标记造影剂，给药剂量通常较大，所以其导致的安全性问题与治疗性药物相似，通常应将其与治疗性药物同等对待，本文不再赘述其安全性评价相关内容。
2)临床试验设计相关考量
a) 研究人群
荧光造影剂的两个常见应用为：
（1）为疑似疾病的患者提供诊断；
（2）监测和评估确诊患者的进展。
建议有效性研究纳入疾病状况不明、但临床表现的特定方面导致需要更多诊断信息的受试者。
b) 有效性的确立
诊断的准确性和临床价值的评价，建议通过研究确定显像剂的有效性和可靠性（检测结果的可重复性）。
诊断准确性：是指待评价的体内诊断药物（简称：待评价品）对本病的诊断结果与金标准（或参考标准）的一致程度。诊断准确性可以使用多种指标进行评价，如灵敏度、特异度、预测值和受试者工作特征（ROC）曲线下面积等[26]。
灵敏度（sensitivity）=TP/(TP+FN)；又称真阳性率，是指实际患本病且被正确诊断为患本病的百分比。
特异度（specificity）=TN/(FP+TN)；称真阴性率，是指实际未患本病且被正确诊断为未患本病的百分比。
假阳性率(FPR, false positive rate)= FP / N = FP / (FP + TN)=1-specificity；实际未患本病却被诊断为患本病的百分比。
假阴性率 (FNR, false negative rate)=FN/N；实际患本病却被诊断为未患本病的百分比。
阳性预测值 (PPV, positive predictive value)，PPV = TP / (TP + FP)；在诊断为患本病的人中实际患本病的人所占百分比。
阴性预测值 (NPV, negative predictive value)，NPV = TN / (TN + FN)；在诊断为未患本病的人中实际未患本病的人所占百分比。
准确性（accuracy）=(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN)。
ROC曲线：根据一系列不同的二分类方式（截断值），以真阳性率（灵敏度） 为纵坐标，假阳性率（1－特异度）为横坐标绘制成的曲线。曲线下面积越大，诊断准确性越高。
临床价值：指南建议在关键临床研究中对新造影剂是否改善了临床结局或预后进行前瞻性评估。临床有效性通常可以通过两种方式来确定。
（1）通过临床研究中进行直接证明；
（2）通过与历史数据对比。
c) 对照的选择
可以使用历史对照（如肠息肉早期诊断相关产品开发，避免不必要的肠镜检查）；
与器械联用的，建议与该器械不使用造影剂组作对比；
也可以使用阳性对照（其他产品或标准）；
还可以采用标准治疗加载设计。
六、靶向荧光造影剂展望
未来，通过改良荧光染料及靶向分子的选取，研发新型荧光分子、靶向配体和可调控荧光显影剂，能够有望提升靶向荧光显影剂的灵敏度和特异性，从而更为有效地实现病变组织的定位和成像。
总之，靶向荧光显影剂及多模态成像技术将在精准手术时代发挥着关键作用。开发新型、高效、安全的医学显影剂成为当前医药研发领域的重要方向之一。
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