前言

多数疾病的发生和发展皆与蛋白的异常表达或聚集有关，传统的药物开发思路是通过小分子或蛋白类的抑制剂占据和阻断靶蛋白的活性作用位点，抑制蛋白的功能活性。然而在人体内大约有80%的“不可成药”靶点，难以通过占据活性位点发挥治疗作用，给药物开发带来了巨大的挑战^[1,2]。

PROTAC技术，又名蛋白降解靶向嵌合体技术，是一种利用细胞的泛素-蛋白酶体系统来清除不需要的或受损的靶蛋白的药物开发技术。该技术是通过形似“哑铃”的双功能小分子实现的，如图1所示，其结构由三部分组成：靶蛋白配体、连接子和E3连接酶配体。

图1：典型的PROTAC结构和示例（ARV-110）^[3]

1.作用机制

蛋白质降解是调控细胞内蛋白质稳态的重要机制，泛素-蛋白酶体系统和溶酶体途径便是细胞内蛋白质降解的两个主要途径。

泛素（Ubiquitin）是一种由76个氨基酸组成的小分子调节蛋白（8.5KDa），存在于所有已知的真核生物体中。如图2，泛素结合到底物蛋白质分子的特定位点上的过程叫泛素化（Ubiquitination），这一过程主要由泛素激活酶E1，泛素结合酶E2和泛素连接酶E3介导。泛素化是一种细胞内的蛋白质标记系统，它通过给有缺陷/受损的蛋白质打上“废弃”的标签，从而泛素化蛋白质最终会被26S蛋白酶体识别并降解。

PROTAC药物可在特异性结合靶蛋白的同时招募E3泛素连接酶，形成三元复合物后（如图3），使靶蛋白被E3泛素连接酶识别进而被泛素化，最后被细胞内的蛋白酶体识别并降解，释放的PROTAC可被循环利用。

图2：泛素-蛋白酶体系统介导的蛋白质降解^[4]

图3：PROTAC药物的作用机制^[3]

2.作用特点

大多数小分子药或单克隆抗体需要持续占据靶蛋白的活性位点以阻断其功能，称之为占位驱动（occupancy driven）。而PROTAC药物采用事件驱动（event driven）的作用模式，面对缺乏高亲和力配体结合位点的靶蛋白，通过促进E3连接酶的募集，诱导靶蛋白泛素化，随后降解整个蛋白。

如表1所示，与小分子抑制剂、单抗、核酸药物相比，PROTAC药物体现出显著的综合优越性^[5]。一是具有用量小、效率高的优势，能够清除致病蛋白，在靶蛋白突变或者表达量低的情况下，比小分子药物抑制剂具有更好的耐受性；二是具有一定的组织渗透性，可作用于细胞内靶标，而单克隆抗体则难以靶向细胞内的靶标；三是与小核酸药物相比，PROTAC对基因组和转录组的影响可忽略不计，且可开发成口服给药的制剂，一定程度上提高了病人的依从度和药物的可及性。

表1：PROTAC药物的特点

PROTAC技术的概念最先是在2001年由耶鲁大学的Craig Crews教授和美国两院院士Raymond Deshaies提出的。2008年，Crews团队报道了首个小分子PROTAC，其实现了对雄激素受体的有效降解。2013年，Crews教授基于PROTAC技术建立Arvinas公司，致力于开发治疗癌症的药物。在2019年，Arvinas公司开发的ARV-110成为了第一个进入临床试验的PROTAC药物。

图4：PROTAC近20年的发展历程^[6]

PROTAC技术经过20年的不断完善和发展，已经从学术界走向工业界，全球范围内在研的PROTAC药物二百余种，且多数处于临床前的研究阶段，暂无相关产品获批上市。目前处于临床阶段的PROTAC药物如表2所示。其中，Arvinas和辉瑞公司共同开发的靶向降解雌激素受体的ARV-471，适应症为ER+/HER2-乳腺癌，是目前进展最快的产品，处于临床Ⅲ期，且已公布的研究结果显示其耐受性良好。根据PROTAC-DB数据库^[7]，目前披露的PROTAC分子达3270种，涉及280种靶蛋白。

表2：处于临床阶段的PROTAC药物

尽管PROTAC作为一种新兴的治疗技术，具有调节不可成药靶标的潜力，但在研究中也面临着很多挑战。结构决定性质，PROTAC分子不符合Lipinski's Rule of 5（即类药五原则，是辉瑞公司资深药物化学家Christopher A. Lipinski在1997年提出的筛选类药分子的基本法则，符合Lipinski规则的化合物会有更好的药代动力学性质，在生物体内代谢过程中会有更高的生物利用度，因而也更有可能成为口服药物。），分子量太大，溶解度不佳，相较于传统小分子表面的极性区域更大，这些特性可能会影响到药物分子的渗透性。为获得具有一定口服生物利用度的分子，在研发时可从结构设计、机制创新和有效的临床前评价等多方面进行考量^[8]。

在PROTAC分子开发策略中，Zeng等人给出了分子优化的参考建议^[9]，在E3连接酶的选择上，常用的主要有CRBN、VHL、cIAP和MDM2，其中使用频次最高的是CRBN和VHL两种，进入临床的分子经披露的也多为CRBN配体，这是因为这类配体相关的分子更小、更灵活、更具可成药性。在靶蛋白配体的选择上，低分子量和低氢键供体的特性也是提高分子生物利用度的考虑因素。除此之外，连接子的选择也是非常关键的，其长度、组成、柔性、构象都会影响分子的渗透性以及在溶液中的形态，例如，在烷基链、聚乙二醇链中引入环烃/苯环，调整长度或者使用环状连接子等策略也可能提高代谢稳定性。

除了在结构上的优化，改善溶解度而提高口服生物利用度的策略也可从制剂层面加以考虑，比如在处方筛选时加入合适的辅料（pH调节剂、环糊精、表面活性剂和脂质成分），开发无定形固体分散体，纳米递送/外泌体等等。

目前还没有针对PROTAC非临床研究的专有指南，该领域也暂无产品上市，可参考的权威资料有限。体内外安全性评价与常规小分子化药要求类似，原则上可参考ICH M3、S9，研究过程中还需针对PROTAC的特性而对试验设计进行考量及优化^[10]。

1.药效评价

在药效评价中，除了强调相关种属和能反应疾病机制的模型选择，需要特别关注的是量效关系验证。因为PROTAC在药动学方面与经典的抑制剂不同，高浓度时经常会观察到“HOOK效应”（图5），也就是在高浓度情况下形成PROTAC:E3连接酶和PROTAC：靶蛋白二元复合物，阻碍了靶蛋白降解所必需的三元复合物的形成。因此，药效试验要结合药动学参数设置给药剂量，避免二元复合物的形成，制定合理的给药方案。药效除观察指标外，应尽量选择合适的药效标志物，如通过WB等对目标（致病）蛋白的表达量进行测定，以验证PROTAC药物对靶点的选择性。

图5：HOOK效应^[11]

2.药代动力学评价

PROTAC的相对分子质量一般较传统小分子更大，口服吸收具有挑战性，但一旦被吸收，与小分子在体内的循环无差异。经静脉或皮下注射给药在体内的代谢特点也与小分子相似，暴露量与给药剂量相关。

需要注意的是，除关注PROTAC药物本身的药动学特性外，还需要重点关注三元复合物的形成和稳定性问题。在代谢研究中，可以通过质谱确定体内外代谢产物的种类和结构，包括是否存在二元复合物以及游离个体，从而阐述药物进入体内后的代谢途径；以及通过比较不同动物中的代谢产物和比例，为相关种属的确定提供重要依据。

3.安全性评价

PROTAC药物的安全性评价试验的检测项目及指标可参照常规化学药物的检测进行，包括一般毒理、安全药理、遗传毒性和生殖毒性等。

除需要考虑药物整体的安全性外，也需要考虑分子结构中各组分潜在的毒性问题；确定分子在在体内连接子是否会断开，药物的组成部分是否会分离，继而需要考虑各组分单独的安全性情况。针对PROTAC的稳定性、生物分布和血管穿透性差的特性，要充分考虑其代谢产物和（或）形成的复合物的毒性，及其因蓄积引起的脏器损伤问题。

另外，基于PROTAC药物的作用机制，剂量-毒性反应关系可能不同于小分子药物，在进行剂量选择时，需进行充分的预试验探索，确定起效剂量与毒性反应剂量之间的关系。同时，如在暴露量饱和时观察到毒性反应严重程度较轻，建议继续升高剂量，监测药物暴露量的基础上，观察在“HOOK效应”下形成二元复合物时，药物的潜在毒性反应，以更好的指导临床安全性研究。

重复给药的给药周期一般需长于临床试验以及药物上市后治疗期限，参考ICH M3，给药频率根据药物的药效/药代参数和临床拟用频率进行设计，一般大于临床给药频率。重复给药中的伴随毒代至关重要，可以通过暴露量作为风险控制的重要依据。除需要监测母药的暴露量外，还需结合不同种属中代谢产物鉴定的结果，对可能存在的表达量较高的游离组分、形成的复合物以及代谢物进行监测。

在遗传毒性的研究中，除需要对PROTAC药物进行整体的检测，针对在体内会发生断裂的药物，还需要对游离各组分进行研究。关于生殖毒性的风险也需要引起重视。因为CRBN的一个主要配体就是沙利度胺类衍生物，因此针对临床用药人群，参考潜在的安全性信息及部分试验结果，在适当的时候开展相关毒性评估，观察致畸作用以外的非预期毒性反应。

另外，脱靶毒性也是最为关注的问题之一，PROTAC降解蛋白的作用使得相比小分子药物对非靶靶蛋白的影响更为深远。脱靶毒性在毒性筛选中不易检测和追踪，缺少有效的检测手段更是增加了风险。一项在关于靶向蛋白降解剂非临床安全性评价的行业调研推荐了蛋白质组学研究的策略^[12]，以便能更全面的评估可能的在靶和脱靶蛋白的变化。

PROTAC技术作为一种新型的靶向治疗方式，在克服耐药性、影响靶蛋白非酶活功能、降解不可成药靶点等方面表现出巨大的优势，目前已经有越来越多的产品从基础研究进入了临床试验。然而相较于小分子药物，其在稳定性、溶解度、渗透性和组织分布方面的优化和改善依旧是需要关注的问题。其次，如何快速有效筛选目标蛋白配体，如何拓展E3泛素连接酶及其配体，如何有效评估降解活性、选择性及脱靶效应等都是亟待解决的问题。

希望随着更多的非临床研究和临床试验的开展，数据的积累，新的评价方法和体系的建立，从基础研究和应用两个层面共同出谋划策以解决这些问题，发挥出更大的临床价值，早日满足未被满足的临床需求，使更多患者获益。

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