2023年诺贝尔生理学或医学奖授予了Katalin Kariko博士和Drew Weissman博士，肯定了他们在核苷酸修饰方面做出的杰出贡献，而这一技术极大的推动了mRNA疫苗抗击新冠疫情的研究进展。无独有偶，在17年前，2006年诺贝尔生理学或医学奖授予了Andrew Z. Fire博士和Craig C. Mello博士，肯定了他们在RNA干扰方面做出的杰出贡献。
这一技术实现了基因沉默，为后来siRNA药物的研究开发奠定了基础，短短20年间，就有两项RNA相关技术被赋予科学最高奖项，由此而生的RNA药物，未来可期。
一
基因治疗的定义
二
基于“中心法则”的药物开发策略
中心法则（Central Dogma）是1957年由Francis Crick首次提出的关于DNA、RNA及蛋白质三者之间关系的规律，如图1所示（Crick在1956年的手绘）。简言之，DNA可以转录为mRNA，也可自我复制；mRNA可以翻译为蛋白质，也可自我复制，也可逆转录为DNA；但是蛋白质不可以反向生成RNA或者DNA。
显然，在药物与疾病斗争过程中，可能存在两套“中心法则”。一套是疾病发生的“中心法则”：错误的DNA转录为错误mRNA，进而翻译为错误的蛋白。如果我们将该路径中任意一步破坏，就有可能阻止或者延缓疾病的进展。例如，作用于错误的DNA片段，或者阻断其转录，或者作用于错误的mRNA，或者阻断其翻译，或者作用于错误的蛋白。
另外一套是药物作用的“中心法则”：如果我们将DNA、RNA或者蛋白质任意一种物质，递送进患者体内，就有可能依据信息传递的路径发挥作用。例如，直接递送蛋白（例如依洛尤单抗注射液），或者递送能够翻译该蛋白的mRNA，或者递送编码该蛋白的DNA。更有趣的是，递送一些能够干扰错误转录或翻译的物质（例如药物Inclisiran），或者直接递送一些“剪刀”破坏错误的基因（例如药物NTLA-2001）。
三
基于PCSK9靶点的药物迭代之路
以前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）靶点为例，以RNA相关技术为重点，我们梳理一下药物迭代之路，更全面理解基因治疗的作用机制及优势。低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）是引发心脑血管疾病的重要因素，如何降低LDL-C的含量，研究人员提出了多种策略。
1.“一代药王”阿托伐他汀
在PCSK9靶点兴起之前，抑制胆固醇的合成，是研究的重点。胆固醇有一系列复杂的合成机制，其中羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶是胆固醇合成的限速酶，抑制该酶的作用，就能够抑制胆固醇的合成。于是，HMG-CoA还原酶成为一个可能的靶点。后来，一系列他汀类化合物被合成，可以有效抑制HMG-CoA还原酶。其中，某国际药企的阿托伐他汀（立普妥）脱颖而出，成为医药史上第1个“超级重磅炸弹”。该类药物的策略是找到胆固醇合成路径中的一个靶点蛋白，将其抑制。
他汀类药物降脂效果有限，且有一定副作用。如果不能抑制胆固醇的合成，但能够加速胆固醇的代谢，也不失为一种好办法。研究人员发现， PCSK9与LDL-C竞争性结合低密度脂蛋白受体（LDL-R），导致LDL-C不能够与LDL-R有效结合，从而拖慢LDL-C的代谢速度。如果我们能够拮抗PCSK9，LDL-C就有更多与LDL-R结合的机会，从而加速其代谢。PCSK9就成为新兴的靶点，PCSK9单抗应运而生。目前我国已有多款单抗产品获批上市（表1）。该类药物的策略是找到影响LDL-C代谢的因素蛋白，利用抗体捕捉该蛋白。
基于PCSK9靶点，与其用抗体去捕捉该蛋白，不如设法阻止PCSK9蛋白的上游mRNA的翻译。这样的思路得益于2006年诺贝尔生理学奖或医学奖siRNA技术的研究发现。如图2所示，siRNA是一类双链RNA（Double-stranded RNA, dsRNA）,它与Dicer蛋白结合，被该蛋白分解为小片段。这些小片段再与RISC复合体结合，与mRNA去配对，于是mRNA被分解破坏掉，达到沉默mRNA翻译的目的。
Inclisiran是全球首款降脂的siRNA药物，通过与N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）配体共价连接，结合肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体，进入体内，破坏掉翻译PCSK9蛋白的mRNA，从而降低PCSK9蛋白的表达。每6个月皮下给药一次，大大增加了患者的依从性。在此之前，全球首款siRNA药物Patisiran上市，用于治疗遗传性甲状腺素介导的淀粉样变性的多发性神经病（hATTR）。该药物首次使用脂质纳米颗粒（LNP）递送进人体，为后来新冠mRNA疫苗的递送技术奠定了基础。
图 2 RNA干扰机制示意图[1]
截止2023年10月，FDA共批准6款siRNA药物，如表2所示：
表 2 已上市siRNA药物
药品名称 | 研发公司 | 适应症 | 载体 | 上市日期 |
Patisiran | Alnylam | hATTR | LNP | 2018年 |
Givosiran | Alnylam | 急性肝卟啉病 | GalNAc | 2019年 |
Lumasiran | Alnylam | 1型原发性高草酸尿症 | ESC-GalNAc | 2020年 |
Inclisran | Novartis | 降血脂 | GalNAc | 2021年 |
Vurisiran | Alnylam | hATTR | ESC-GalNAc | 2022年 |
Nedosiran | Novo Nordisk | 1型原发性高草酸尿症 | GalNAc | 2023年 |
更进一步，与其阻止mRNA的翻译，不如直接将PCSK9的基因敲除，一劳永逸。Crispr-Cas9系统是最常用的基因剪刀，如何把这套系统直接递送至体内发挥作用呢？其中一个策略就是借助可以翻译Cas9蛋白的mRNA，让其与gRNA（化学合成）一起打包在脂质纳米颗粒（LNP）中，被递送进人体细胞。
Cas9蛋白被翻译之后，与gRNA组装为Crispr-Cas9系统，发挥基因剪刀的功能，敲除靶基因。相比mRNA新冠疫苗或者肿瘤疫苗来说，这无疑是一种大胆的创新，其翻译产物是另外一套系统的组成部分，在体内临时组装，这大大拓展了mRNA的应用范围。
Kiran Musunuru研究团队[4]就试图利用这样一套作用机制去敲除灵长类动物的PCSK9基因。该产品是将化学合成的sgRNA与翻译Cas9蛋白的mRNA包裹在LNP中，递送进食蟹猴体内。试验显示，单次给药后，肝脏中的PCSK9基因几乎完全被敲除，同时血液中的PCSK9蛋白下降了近90%，LDL-C下降了近60%，并且该效果持续了至少8个月。该研究为肝脏内Crispr精准编辑单基因治疗心血管疾病提供了动物水平的证据。
相似的，另外一款产品NTLA-2001，也是全球首个体内基因编辑疗法，用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR），2023年10月18日获批III期临床。该产品采用LNP递送系统，携带靶向人TTR（转甲状腺素蛋白）基因的sgRNA和翻译Cas9蛋白的mRNA序列。其作用机制如图3所示。I期临床试验（NCT04641051）结果显示，该产品具有剂量依赖性。给药后28天，低剂量组（0.1mg/kg）血清中TTR平均下降52%，高剂量组（0.3mg/kg）血清中TTR则平均下降87% [3]。
1961年，发现mRNA
1976年，首次聚合物体内递送核苷酸
1978年，脂质体递送mRNA入人体细胞及小鼠细胞
1995年，首次mRNA肿瘤疫苗在小鼠体内完成试验
2005年，Kariko，Weissman团队首次报道，核苷酸修饰技术可以减少Toll样受体（TLR）识别mRNA的作用
2008-2012年，Kariko，Weissman团队进一步证明，核苷酸修饰技术可以降低mRNA被分解，提高mRNA翻译能力
2017年，首次个体化mRNA肿瘤疫苗开展临床试验
2020年，2款新冠mRNA疫苗（mRNA-1273和BNT162b2）在美国获批紧急使用
2021年，新冠mRNA疫苗LNP的佐剂作用被证实
非复制型mRNA的结构如图4所示，主要由开放阅读框（ORF，目标蛋白编码区）、5’端非编码区（5’-UTR）、3’端非编码区（3’-UTR）、5’端帽子结构及3’端PolyA尾所组成。
本文主要介绍非复制型mRNA的工艺流程及质控要点。其工艺流程简图如图5所示，大致分为起始原材料（线性模板）的获得（过程1）、mRNA原液制备（过程2）以及载体包装（过程3）等三个过程，其主要关键技术包括模板序列的设计、体外转录的方法以及载体设计等。
图 5 mRNA工艺简图
如图6所示，mRNA质量研究主要包括mRNA结构及理化性质、纳米颗粒结构及理化性质（以LNP为例）、杂质分析和生物活性分析四大方面，贯穿于工艺流程始终。
图 6 质量研究考虑要点
目标蛋白的序列（ORF）固然重要，非编码区序列（UTR）同样重要，它们关系到mRNA的稳定性以及翻译效率。序列的确证始于质粒构建，终于产品放行，贯穿于制备全过程。另外，关键的质控点包括质粒构建及菌种库建立检定、线性模板的质量控制、mRNA原液的质量控制以及成品的质量控制等。其考虑要点如表3、表4所示。
表 3 质粒构建、菌种库建立检定考虑要点
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表 4 关键质控点考虑要点
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四
结语
本文所列举的RNA相关技术及产品只是基因治疗之一隅，它们幸运的被研究人员发现、试验和成功商业化。事实上，还有更多形式的创新技术和开发策略破土而出，或者正在经历黎明前的至暗时刻，或者成功迭代上市。我们相信，一代又一代研究人员前赴后继，基因治疗必将有更广阔的天地。
参考文献
[1] COMMITTEE N. siRNA作用机制图[J]. 2006.
[2] LIU C, SHI Q, HUANG X, et al. mRNA-based cancer therapeutics[J]. Nature Reviews Cancer, 2023, 23(8): 526-543.
[3] GILLMORE J D, GANE E, TAUBEL J, et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis[J]. New England Journal of Medicine, 2021, 385(6): 493-502.
[4] MUSUNURU K, CHADWICK A C, MIZOGUCHI T, et al. In vivo CRISPR base editing of PCSK9 durably lowers cholesterol in primates[J]. Nature, 2021, 593(7859): 429-434.
[5] HUANG X, KONG N, ZHANG X, et al. The landscape of mRNA nanomedicine[J]. Nature Medicine, 2022, 28(11): 2273-2287.
[6] CDE. 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）[EB/OL] (2020-08-14)[2023-10-26].
