前言
自诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSC）技术问世以来，干细胞生物学和再生医学取得了重大进展。iPSC是指通过对体细胞进行人基因的重编程，逆分化培养出的一类具有类似胚胎干细胞（ESC）特征的多能干细胞。iPSC技术可溯源至2006年，日本京都大学的科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）团队借助病毒载体将4个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc导入小鼠的成纤维细胞，发现能诱导其转化形成iPSC[1]。
2007年，Yamanaka团队成功地将人类体细胞转化为与人类ESC（hESC）具有相似基因表达谱和多能性的干细胞[2]，这些细胞被称为人类iPSC（hiPSC）。该技术于2012年获得诺贝尔生理学医学奖，自此关于iPSC的研究在全球范围内全面展开。
hESC存在最大的难题就是用人类受精卵培养的伦理问题，而iPSC技术为这一难题提供了完美的解决方案。iPSC来源广泛，具有较强的体外扩增、复制和分化能力、较低的免疫原性、较高的基因编辑效率等。基于这些优势，iPSC技术已广泛应用于疾病建模、药物发现和开发[3]，是个性化细胞治疗和再生医学研究的重要科学工具。
图1 来源于iPSC的特定细胞和类器官在疾病建模、药物发现和细胞治疗中的应用[3]
研发进展
2020年，QYRESEARH报告显示，iPSC市场的全球收入在2019年价值8052万美元，预计到2025年将达到1.6亿美元，预计全球收入的复合年增长率为12.26％[4]。
图2 2014-2025年全球诱导多能性干细胞市场规模和增长率（百万美元）[4]
根据“Clinicaltrials.gov”数据库的检索结果，截至2023年3月底，有关iPSC的临床试验有137项。自2015年开始，iPSC相关临床试验数量有显著提升，于2018年达到峰值并有所回落，到2022年临床试验数量再度增长，为15个[5]。
图3 全球iPSC相关临床试验[5]
iPSC管线最快的已经进入Ⅲ期临床（Cynata Therapeutics），大部分处于Ⅰ期临床及临床前阶段。
表1 全球进入临床阶段的iPSC治疗产品[5-7]
iPSC来源的在研产品适应症以肿瘤为主（43%），帕金森、眼科疾病和心力衰竭次之。最多的iPSC衍生细胞类型是CAR-iNK（27%），多巴胺能神经前体细胞、CAR-iMac和i-MSC紧随其后[5]。
图4 全球iPSC在研产品按适应症拆分
图5 全球iPSC在研产品按衍生种类拆分
制备
制备流程
iPSC衍生的同种异体产品的生产过程可分为三个主要阶段[8]。
第一阶段，供体材料（即细胞）通过引入重编程基因（如Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc [OKSM]）而经历重编程过程，这些重编程基因由病毒或非病毒重编程载体瞬时表达。重编程的细胞可以进行扩增和储存，建立iPSC库，成为一个具有无限扩增能力的可再生细胞来源。多能干细胞在未分化状态下扩增的能力使得其在后续过程中可以进行更广泛的遗传修饰和更大规模的生产。
第二阶段，可对重编程iPSC进行进一步的基因修饰，利用病毒载体、非病毒基因编辑组件（如质粒DNA、mRNA、RNA复制子）、酶（如CRISPR/Cas9）或转座子介导的基因编辑引入产品特异性的基因修饰。基因修饰会破坏内源基因，或引入与产品功能相关的基因。
第三阶段，在进行基因修饰后，可对经过修饰的细胞进行克隆筛选步骤（即克隆过程），在这一步骤中，可扩增克隆并筛选多个克隆，以挑选具有适当性能特征的单克隆用于后续的生产。挑选的克隆可以扩增产生种子细胞，再进一步扩增为主细胞库（MCB）。
iPSC衍生的异体细胞产品的生产过程可始于MCB复苏。在某些情况下，可以使用两级库策略，WCB（工作细胞库）可以从MCB扩增。来自MCB或WCB的iPSC通常在未分化状态下扩增，以达到所需的生产规模，并进一步加工以诱导分化成为预期的细胞表型；加工过程包括分化、成熟或激活以产生具有生物学活性的原液。然后配制、灌装和低温保存，成为最终的药品。
图6 iPSC衍生的同种异体细胞产品生产过程[8]
iPSC制备的关键因素
iPSC的制备受多种因素影响，其中细胞来源的选择、重编程因子的筛选、重编程载体的选择、培养基和培养基质、培养方式和iPSC的筛选鉴定等均为关键因素。
1、细胞来源的选择[9]
iPSC最初是从小鼠成纤维细胞中建立的，因为这些细胞易于处理、能大量增殖。然而，人类原代成纤维细胞的建立需要皮肤活检，这涉及侵入性外科手术和专业技能。因此人们开始寻求更容易获得的细胞来源。外周血细胞是一种理想的细胞来源，iPSC可以来源于T细胞、B 细胞、造血干细胞和纤维细胞。
iPSC也可以从毛囊中分离的角质形成细胞、牙齿和脂肪组织中的间充质干细胞、骨髓细胞和尿液中的肾上皮细胞、胚胎和胚胎外组织样脐带血和羊膜细胞、胃和肝细胞、神经干细胞和祖细胞以及黑色素细胞中重编程获得。
总之，人体中的所有细胞都有可能成为iPSC，但效率不同。选择细胞来源时值得考虑的一点是，即使在重新编程后，iPSC也可以保持部分原始表观遗传状态。虽然这种记忆可以通过长时间的培养来消除，但它会影响iPSC的分化能力。受体细胞类型也会影响基因传递方法的选择，因为它会影响基因传递的效率。
2、重编程因子的筛选[9]
在OSKM中，Oct3/4、Sox2和Klf4作为维持iPSC多能性的基因的正调节因子，会抑制分化基因的表达。第四个因子c-Myc被证明对于重编程是不必要的，但它的使用显著提高了效率。c-Myc在重编程机制激活多能调节因子之前发挥作用，其影响的是细胞增殖，而不是多能性。
此前，由James Thomson领导的一个研究小组使用Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28诱导体细胞形成hiPSC。自这一发现以来，研究人员已经证明，将一种特定的体细胞类型重编程为iPSC状态，使该细胞有可能变成体内任何类型的细胞。除了OSKM和Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28外，转录因子Glis1和Nr5a2可以分别替代c-Myc和Oct3/4，Sall4可以显著提高效率。细胞增殖和凋亡相关因子cyclin D1和TP53也可以作为c-Myc的替代品。
研究表明，miRNA或控制miRNA合成的基因（miR-302、miR-372和Lin28）和表观基因组修饰因子（Suv39h 、Wrd5和Jhdm1a）也能有效地进行重编程。作用于表观遗传学的小分子可以通过修饰DNA甲基化（5-aza-cytidine和RG108）、组蛋白乙酰化（丁酸钠和trichostatin A）或组蛋白甲基化（Neplanocin A）来提高重编程效率。此外，研究发现小分子化合物也能够替代重编程转录因子。例如，8-br-cAMP是cAMP依赖性蛋白激酶的激活剂，可增强人成纤维细胞重编程效率。最后，转化生长因子（TGF）-β1型受体抑制剂 Alk5可以通过激活Nanog表达来促进iPSC重编程。
3、重编程载体的选择[3,9-15]
根据载体类型的不同，目前诱导重编程的载体大致可以分为整合型和非整合型。
3.1 整合型载体
（1）病毒整合型载体，常利用逆转录病毒和慢病毒载体等实现基因重编程。最初iPSC的制备使用的是逆转录病毒载体，用于表达外源重编程因子，附着到细胞表面后，该载体将重编程基因引入受感染的细胞，并将其整合到宿主基因组中。慢病毒载体具有相似的特性，且具有更高的重编程效率和更少的变异性。这些病毒系统有利于因子高表达、持续表达和高效的iPSC生成，但整合型病毒会带来安全性风险，包括细胞毒性、细胞免疫反应、转基因整合到宿主基因组以及非特异性突变的产生[9]。
（2）非病毒整合型载体，如转座子。转座子是基于DNA的载体，其中PiggyBac转座子是一种常用的方法。PiggyBac转座子可携带重编程因子，在催化酶转座酶的作用下整合到宿主基因组中，但其可以在iPSC生成后利用PiggyBac编码的转座酶将外源基因从宿主基因组中切除。在大多数情况下，这种切除不会在基因组上留下任何痕迹，使iPSC临床应用的风险大大减小[9]。
3.2 非整合型载体
（1）病毒非整合型载体，如腺病毒载体降低了转基因被重新激活的风险，但重编程效率低，产生的iPSC不能达到与临床应用相适应的水平。仙台病毒是单链RNA，在细胞核外进行复制，被认为是最安全的病毒方法，通过对仙台病毒进行删除F基因并引入温度敏感性突变进行修饰，可阻止基因传递并减少重编程载体的传播，包含在细胞质中的病毒载体最终会被稀释掉，从而留下无印迹的iPSC[9-13]。
（2）非病毒非整合型载体，如来自EB病毒的包含EBNA-1和OriP两种DNA序列的附加体型质粒已显示出良好的应用前景。该质粒在感染人细胞后表达EBNA-1蛋白，然后识别OriP序列以诱导质粒的游离扩增。OriP和EBNA-1序列可确保在每次细胞分裂期间重编程载体的复制和保留，从而驱动重编程基因的高表达并促进单次转染后的iPSC产生。每个细胞周期附加体型载体的丢失速率约为5%，因此iPSC生产过程中可自行去除载体而无需额外的操作，从而产生不含转染DNA和整合入基因的无印迹iPSC[9,14,15]。
直接导入RNA的方法也可以生成iPSC。如修饰的核苷酸用于合成编码重编程因子的RNA。这些修饰的RNA的重复转导已从人成纤维细胞和外周血中生成了iPSC。由于转导的RNA通过干扰素途径诱导先天免疫反应，因此使用牛痘病毒的重组B18R蛋白来最大程度地降低这种风险。这种方法被认为比基于DNA的方法具有更低的致突变风险。也有报道用重组蛋白生成iPSC，在这项技术中，重编程因子与细胞穿透肽融合以促进它们在细胞中的转导[9]。
上述方法具有不同的重编程效率、技术难度和基因组整合性。应根据iPSC的应用目的，判断使用哪种方法应基于该技术的效率和安全性。对于临床应用，无论效率如何，安全性都是最重要的。最初的重编程方法被禁止临床应用，是因为逆转录病毒对c-Myc的稳定基因组整合增加了重编程细胞致瘤的风险。理想情况下，外源重编程因子不会整合到宿主细胞染色体中。仙台病毒和DNA载体（例如附加体型质粒）提供了这种可能性，已被广泛应用。基于RNA或蛋白质的方法整合风险最低，但它们在技术上仍然存在困难[9]。
图7 产生iPSC的各种细胞来源和重编程方法[3]
4、培养基和培养基质[16,17]
在扩增过程中控制iPSC质量的关键是使用特性良好的原材料，其中细胞培养基和基质起着重要作用[16]。
在设计iPSC培养基时，一种策略方法是确定多能性依赖的信号转导途径中涉及的生长因子。调控干细胞多能性基因水平的通路多种多样，如转化生长因子（TGF）-β超家族激活级联反应、受体酪氨酸激酶信号通路（碱性成纤维细胞生长因子（bFGF））、Rho/ROCK（Rho依赖性蛋白激酶）信号通路等[16, 17]。
TGF-β超家族蛋白，例如TGF-β 蛋白、激活素、Nodal和骨形态发生蛋白 （BMP），在维持iPSC的多能性方面也发挥着重要作用。TGF-β1已被证明有助于维持hiPSC 的多能性。Nodal和激活素A激活相同的受体和信号传导，以抑制hiPSC分化并维持多能性。
然而，高浓度（约100 ng/mL）的激活素A也会促进hiPSC分化为中内胚层细胞。因此，为了维持hiPSC的多能性，激活素A的浓度应保持在50 ng/mL以下。BMP-4可诱导hiPSC的分化，拮抗剂noggin与bFGF共同抑制BMP-4诱导hiPSC分化的作用并维持hiPSC的多能性[17]。
bFGF对于hiPSC的多能性和增殖至关重要。然而，由于bFGF缺乏热稳定性，因此需要频繁更换介质，这增加了大规模生产的成本。使用一些方法，如使用控释微球稳定bFGF水平和改进bFGF热稳定性，可降低培养基更换频率[17]。
ROCK抑制剂如Y-27632和thiazovivin在hiPSC的生产中具有重要作用。研究表明添加 ROCK抑制剂可显著提高hiPSC传代后的细胞存活率、提高hiPSC冷冻保存效率、促进hiPSC扩增和增强hiPSC分化[17]。
通过提供特定的细胞因子和细胞外基质（ECM），以饲养细胞为基础的基质，可防止iPSC自发分化，并改善iPSC的贴壁。支持iPSC生长最常用的饲养细胞是灭活的小鼠胚胎成纤维细胞，它们产生多种对多能性维持至关重要的蛋白质，如TGF-β1、激活素A、多营养因子（肝素结合生长因子）等。然而，由于饲养细胞的增殖能力有限，重复传代后支持iPSC多能性的效率降低，以及在iPSC分离过程中存在高污染风险，在饲养层条件下大规模生产iPSC仍存在技术挑战。
此外，动物源性饲养基质可能增加人畜共患病原体和未知病毒向宿主细胞转移的风险，从而导致免疫排斥反应。因此，iPSC培养方法逐渐过渡到使用ECM蛋白、条件培养基或合成生物材料的无饲养层（feeder-free, Ff）和无异源（xeno-free, Xf）培养系统。在已开发的无动物成分（animal component-free，ACF）培养基中，Essential 8?（Thermo Fisher Scientific）培养基是iPSC培养最常用的基础培养基，其含有干细胞增殖最基本的八种元素：DMEM/F12、l -抗坏血酸、磷酸镁、硒钠、FGF-2、胰岛素、NaHCO3和转铁蛋白、TGF-β1或Nodal[16]。
生物材料如水凝胶可促进细胞保持多能性。ECM，如纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白，或来自ECM的寡肽，具有特定的细胞结合结构域，这使得它们成为支持iPSC在无饲养层系统中生长的重要成分。另外，3D生物打印和细胞/组织打印技术也为未来的工艺扩增和自动化解锁了更多的可能性[16]。
5、培养方式[16]
细胞培养动力学在决定iPSC的最终行为和整个生产过程的成本方面起着关键作用。尽管在一次性多层板式生物反应器中已经证明了iPSC在2D静态培养中可以大规模扩增，并且能够监测和反馈控制pH和溶解氧（DO），但2D或3D静态培养条件是一种需要大量人力、金钱成本和空间的方法，且会对培养基成分、代谢废物/产物、旁分泌因子和气体产生不利影响。动态悬浮培养是实现临床应用所需的iPSC密度的最佳方法，悬浮培养的关键考虑因素包括聚集体、微载体和微胶囊等。
（1）聚集体
由于iPSC具有粘附特性，在悬浮培养时，会自发形成3D聚集体（或球体）。iPSC聚集体与拟胚体（EB）非常相似，因此可以作为扩增后直接谱系分化的一种方式。iPSC聚集体的生长和多能性主要取决于微环境、聚集体大小和分布，以及细胞培养容器大小。通过优化一次性生物反应器的叶轮类型和搅拌速度，可以控制iPSC培养中的聚集体大小。通过补充培养基添加物，如维甲酸、类维生素A、ROCK抑制剂Y27632等，可以促进iPSC聚集体形成、扩增并维持其多能性。
（2）微载体
应用微载体进行iPSC培养扩增已取得一定进展。搅拌式微载体培养系统已被证明可以促进贴壁依赖性干细胞的扩增和规模化生产，为监测和控制干细胞分化提供必要的条件，同时可以通过增强氧合和代谢物运输以及降低微环境毒性来提高iPSC的产量。然而，微载体的直径、密度和化学成分会影响细胞的附着，从而影响细胞的扩增能力。由于微珠的表面积有限，iPSC可达到的最大密度似乎受到微珠/细胞比率的限制。附着在微珠上的细胞需要酶解和过滤，可能会降低细胞的活力和多能性。可生物降解的微载体则可以解决这一问题。另外，通过优化生物反应器搅拌速率，也可尽量减少剪切应力对iPSC活力和多能性的不利影响。
（3）微胶囊
与将细胞附着在微珠表面的微载体不同，微胶囊化是将细胞捕获在球形胶囊内。细胞生长所需的营养物质、氧气和其他生长因子可以通过球形胶囊扩散。球形胶囊由半透性材料或膜组成，在悬浮培养系统中可以保护细胞免受团聚和剪切应力的影响。聚合物微胶囊与凝胶微胶囊相比具有一定的优势，每单位体积的胶囊材料可以容纳更多的细胞。此外，由于胶囊内空间存在液体细胞悬浮液，胶囊中的iPSC扩增相对不受限。在微胶囊系统中培养的iPSC既可以维持多能性，也可以被诱导分化，取决于其胶囊的组成和微环境中存在的生长因子的类型。使用微胶囊大规模生产iPSC的缺点与微载体相似，如生产成本高，细胞生长表面积受限。
6、iPSC的筛选鉴定[5,18]
iPSC的筛选鉴定通常可以通过细胞形态、干性/多能性基因检测、三胚层方向的分化标志物检测和畸胎瘤试验等来进行。一般情况下，iPSC应呈克隆团生长、克隆边缘清晰、核质比高、形态均一，克隆内细胞与细胞之间紧密接触；iPSC细胞表面标志物SSEA3、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81中的任意两个阳性率≥70.0%，细胞内部标志物Oct4阳性率≥70%、Nanog阳性率≥70%。
iPSC具有向三胚层方向分化的能力，可通过检测中胚层的平滑肌肌动蛋白（SMA），内胚层的α-胎蛋白 （AFP）和外胚层的 β-III 微管蛋白（TUBB3/ TUJ1）来证明；iPSC经皮下注射到免疫缺陷小鼠的背部，经过一段时间后可产生畸胎瘤。
质量控制
iPSC来源产品制备工艺复杂, 生产使用过程涉及iPSC建库、中间体细胞 （建库，如适用）、细胞培养物收获、冻存/新鲜制剂、临床给药等不同阶段, 全过程各阶段均需进行必要的质量控制。为了确保iPSC来源干细胞产品的安全性、有效性和批间一致性，应对细胞库和制剂进行全面的检定。质量研究内容可结合细胞特性进行选择，尽量覆盖细胞特性分析、理化特性分析、纯度和杂质分析、安全性分析和生物学活性分析等方面，尽可能采用一系列先进、正交的分析技术，且分析方法应经过研究确认，确保方法适用可靠[19]。
表2 iPSC细胞库检定内容
表3 iPSC衍生细胞检定内容
主要风险
iPSC应用场景快速发展，但临床转化仍然遇到了许多问题。目前，基于iPSC的细胞治疗面临最大的三个挑战——致瘤性、免疫原性和异质性[20]。
1、致瘤性
未分化/未成熟细胞引起的致瘤性：iPSC治疗中最严重的问题无疑是畸胎瘤的形成。当移植到患者体内的最终产品存在残留iPSC或高度增殖的祖细胞时，导致畸胎瘤或其他肿瘤。
重编程因子引起的致瘤性：这是iPSC细胞移植所特有的风险。iPSC制备过程中的OSKM重编程因子均与致瘤性相关，尤其是c-Myc。另外，使用增加重编程效率的因子，如p53的显性失活突变体等也会产生致瘤的影响。
基因突变引起的致瘤性：iPSC由于自身生物学特性以及体外较高的倍增次数，会比成体干细胞更容易产生和积累遗传学和表观遗传学变异，如染色体数量和结构异常、基因拷贝数变异（CNV）和点突变（SNV和indel）等。但是，发生基因突变时，并不一定会增加肿瘤风险，并非所有肿瘤基因突变都是致病的。健康的个体也存在肿瘤基因的突变，这就增加了风险分析的复杂性。
2、免疫原性
细胞治疗的另一个关键问题是免疫排斥反应。临床研究表明细胞自体移植可规避免疫应答，但对于一些急性疾病，如心脏衰竭和脊髓受损等，自体移植在时效性方面并不能满足要求。因此，异体移植比自体移植应用更为广泛，但异体移植不可避免会产生免疫排斥反应。
人类白细胞抗原（HLA）的特异性是免疫排斥产生的主要原因。人群中存在一类“超级供体”，其HLA基因5位点是高频单倍体纯合子，基于这些供体制备的细胞可覆盖高数量的受体人群。此外，HLA隐藏技术也是解决该问题的一种免疫抑制方法，可通过删除通用组件B2M基因并引入HLA-E和B2M等基因，制备通用细胞系。
3、异质性
iPSC的异质性是指在每个iPSC系中，其形态、生长曲线、基因表达和分化的倾向都有不同，而这种异质性是iPSC后续应用的主要障碍。遗传变异和表观遗传修饰是导致iPSC产生异质性的主要原因。目前，有的科研人员已尝试利用生长因子与化学抑制剂组合等方式将iPSC由“启动”状态转变为“初始”状态，但技术仍不成熟，获得的初始iPSC可能发生染色体异常和印记丢失等问题。
展望
iPSC技术建立以来，人们在再生医学方面已取得了巨大进展，随着CRISPR/Cas9、3D类器官、微流体等为代表的新技术的出现和不断革新，相信在不远的将来，iPSC的应用会在个体化再生医学方面展现出更广阔的前景。
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