脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一种以脊髓前角及α运动神经元退行性变为主，全身多系统受累的、高致死和高致残率的遗传性神经-肌肉罕见病^[1]。脊髓性肌萎缩症典型临床特征是以肢体近端和躯干进行性、对称性肌肉无力和萎缩为特点，随着疾病进展常累及多系统，最终可导致患儿早期死亡。

95％以上的SMA是由遗传导致的SMN1纯合缺失或突变引起的（图1）。SMN1的缺失或突变导致患者只能依赖SMN2来生产必须的SMN蛋白^[2]。与其他组织相比，运动神经元中SMN的表达水平通常更高^[3]，SMN蛋白的缺乏不利于运动神经元的发育存活，从而导致肌无力和肌萎缩，严重时会累及骨骼肌、呼吸肌、消化道平滑肌等肌肉，进一步使得骨骼系统、呼吸系统及消化系统等产生异常，导致SMA发生发展，危及生命。

图1. 脊髓性肌萎缩症发病原理

临床依据发病年龄和最大运动能力将SMA分为五种表型，并依据不同表型选择不同治疗方式。目前认为疾病的严重程度主要与SMN2拷贝数有关，拷贝数的增加使完整SMN蛋白的数量增多，这有利于运动神经元的发育存活，因此，SMA随基因拷贝数的减少而加重（表1）。

表1. 脊髓性肌萎缩症的不同表型

针对该疾病，目前国际上比较通用的药物共有三种，均为靶向SMN基因的治疗药物，分别为诺西那生钠、索伐瑞韦和利司扑兰。本文主要介绍诺西那生钠（nusinersen，spinraza）相关信息。

  一、反义寡核苷酸药物诺西那生钠

反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）药物是一种治疗性RNA分子^[4]，通过碱基配对特异性靶向RNA，可以诱导靶向蛋白质表达降低或恢复，与化合物相比具有更强的特异性，且由于其在基因水平上进行干预，所以对遗传性疾病提供了治疗选择^[5]。寡核苷酸具有高靶标特异性，可获得以前无法获得的药物靶标，毒性更低且半衰期更长^[6]。

诺西那生钠是反义寡核苷酸药物，这种药物通过干预SMN2剪切将外显子7纳入最终的mRNA转录本，增加完整SMN蛋白的含量。诺西那生钠注射液于2016年12月首次在美国获批，2019年4月在中国上市，是全球首个SMA精准靶向治疗药物。该药物经腰椎穿刺鞘内推注给药，这种给药方式使药物穿过血脑屏障，直接进入脊髓周围的脑脊液中发挥作用。由于药物在体内要经过装载再进行浓度维持，因此，该药品在第0天、第14天、第28天和第63天注射四次负荷剂量，此后每４个月进行一次维持剂量的注射^[7]。

诺西那生钠作用机制是通过与SMN2基因内含子7剪接沉默子（intron splicing silencer,ISS）N1结合发挥作用。ISS-N1位于外显子7下游的5'剪接位点和内含子7的非保守部分，可募集hnRNP A1及hnRNP A2，被募集的hnRNP A1及hnRNP A2会不断积累蔓延至外显子7区域，阻止SR蛋白等促进外显子7识别与剪切的活性分子的结合，从而阻断外显子7的正常包涵。诺西那生钠通过碱基互补配对原则与ISS-N1杂交以阻断hnRNP募集，使得SMN2的pre-mRNA在剪切过程中包含外显子７，增加全长SMN蛋白的产生^[6]（图2）。下文主要介绍诺西那生钠药学研究部分内容。

图2. 诺西那生钠治疗原理

二、诺西那生钠药学研究

2.1. 原料药研究要点

在欧洲药品管理局（European Medicines Agency，‌简称EMA）的公共评估报告中，诺西那生钠的生产过程包括四个工艺阶段：固相合成（粗制中间体的生产）、纯化、最终的脱三苯甲基过程、冷冻干燥（原料药的产生），关键质量属性如下表所示[8]。因现有审评资料未公开诺西那生钠原料药与制剂具体的生产与质量控制细节，此部分内容以寡核苷酸角度对原料药与制剂研究进行阐述。

表 2  诺西那生钠原料药关键质量属性

2.1.1 起始物料核苷单体研究要点

寡核苷酸的关键原料为亚磷酰胺单体，如图3所示，DNA的亚磷酰胺单体主要是由碱基、脱氧核糖、5'-DMT和3'端的2-氰乙基以及二异丙胺基组成；而RNA的亚磷酰胺单体在DNA的亚磷酰胺单体的基础上，需要对2'-OH进行保护，该保护基团一般为TBDMS（叔丁基二甲基硅基）；此外，由于腺嘌呤，鸟嘌呤和胞嘧啶上存在伯胺基，因此也需要一定的基团保护，通常用作这些氨基保护基的是酰基如苯甲酰基（Bz），乙酰基（Ac），异丁酰基等。

图3. 亚磷酰胺单体结构式

通常亚磷酰胺单体合成步骤如下：1）核苷经过酰氯/酸酐处理在碱基上加上Ac,Bz,iBu,dmf等保护基团；2）用DMTrCl试剂，在5'加上DMTr保护基团，成为保护性核苷；3）用磷试剂亚磷酰化合成亚磷酰胺单体。合成步骤如图4所示。

图4. 亚磷酰胺单体合成步骤

一般寡核苷酸亚磷酰胺单体需要进行必要的化学修饰，采用何种化学修饰将会影响最终的核酸药物的成药性、药物的酶抗性以及药物毒性；目前常见的修饰方法主要有：磷酸骨架的修饰、2'位羟基核糖的修饰、核糖五元环骨架修饰以及碱基修饰，具体修饰类型以及所起作用如下表3所示^[9]。

表3. 寡核苷酸常见的化学修饰类型

核苷单体的质量控制也是寡核苷酸合成的关键点，由于核苷单体合成技术环节众多，同时核苷单体经过各种修饰，结构也变得更加复杂多变，杂质团的种类也变得更加繁多，因此在质量控制上也是具有极大的挑战；通常情况下，亚磷酰胺单体的纯度要求一般≥99.0%^[10]。

2.1.2 寡核苷酸的合成

化学合成寡核苷酸的方法历经了半个多世纪的发展，其历程从最初的磷酸二酯法，到磷酸三酯法、氢磷酸法，再到目前较成熟的亚磷酰胺法。现今大多数商业化寡核苷酸合成仪所使用的底层技术是亚磷酰胺三酯合成法，一般称为柱式合成。此方法具有高效、快速偶联等优点，在寡核苷酸化学合成中广泛使用。

亚磷酰胺三酯合成法主要有以下几个步骤：

1）脱保护：使用干燥有机溶剂与酸液（二氯乙酸）除去核苷酸上的5'-DMT保护基团，暴露5'-OH，以供下一步偶联。

2）偶联：单体经过活化后被泵入合成柱，脱保护的5'-OH会与亚磷酰胺四唑活性中间体，形成新的磷氧键，在这一步核苷酸链得到延伸。

3）氧化：偶联反应生成的亚磷酯键，易被酸、碱水解，因此需要进行氧化或硫化操作，形成磷酸二酯（或硫代膦酸二酯）键。

4）加帽：为了防止这些5'的活跃基团与下一个循环加入的活化亚磷酰胺单体发生偶联反应，进而产生N-1杂质，需要对未参与偶联的5'-OH羟基加帽。

5）氨解：在合成循环后，需要对中间产品使用氨水进行氨解反应，将寡核苷酸从固相载体上切割下来并进行基团的脱保护处理。

6）纯化和超滤：可选择离子层析或疏水/反相层析，在层析过程后，需要对产品进行脱盐操作。

图5. 寡核苷酸合成路线

在寡核苷酸合成过程中，若工艺参数控制不好很有可能会产生一系列的杂质，包括产生N-X序列如N-1，N+X的序列，硫代磷酸酯键（PS）产生的非对映异构体和氧化产生PO杂质，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶脱氨基引起的杂质，其他杂质如碱基脱嘌呤杂质，2'-5'连接异构杂质，序列异构体等。具体杂质分类如下表所示^[11]。

表 4 寡核苷酸杂质分类

2.1.3 寡核苷酸的质量控制

由于寡核苷酸药物尚处于早期研究阶段，目前无明确的法规对此类药物研发进行指导，2021年FDA发布关于反义寡核苷酸药物的化学、生产控制指南中提出：对于原料药，FDA推荐采用两种方法进行鉴别，鉴别包括：分子量、序列、液相保留时间等；原料药质量研究内容包括：序列（质谱分析）、残留溶剂、水分、微生物检测、细菌内毒素、有关物质（包括核苷酸序列相关杂质，如n-1、n+1等）、元素杂质、重金属等^[12]。

寡核苷酸药物分析中的难点是杂质分析方法的开发，由于在化学合成过程中，很容易产生寡核苷酸相关杂质，它的化学性质与目标化合物也是非常相似的，这就容易造成分离的困难。阴离子交换（AEX）HPLC法被广泛应用，主要是用来定量分析硫磷二酯中的PO杂质，离子对（IP）HPLC技术用于分离不同长度序列的杂质；近年来，ESI-MS和IP-HPLC-ESI-MS技术也被广泛使用，质量控制内容详见下表所示^[13]。

表 5 寡核苷酸原料药质量控制

关于杂质限度的制定，暂无明确的法规进行参考，根据OSWG白皮书^[13]第10章关于寡核苷酸药物中杂质中指出，建议鉴定限为1.0%，界定限为1.5%；

文章给出制定该标准的理由有三点：

第一：寡核苷酸药物的新杂质或未知杂质的大部分来源于合成，而这些杂质的化学结构很可能与目标化合物相似，它们的化学性质也有可能与目标化合物相似，比如水溶性、与蛋白结合力、分子量等。

第二：由于寡核苷酸药物的分子量与小分子的分子量差异很大，比如，小分子的分子量大概为500Da，而寡核苷酸药物的分子量可能要达到5000Da，它们的分子量相差10倍，因此，在相同的临床剂量下，由于分子量的差异，寡核苷酸的杂质水平为1.0%与小分子药物0.1%的数量相当。

第三：根据现有的毒理学数据，无法证明寡核苷酸药物的毒性是来源于杂质。小分子化药、化学合成多肽药物、寡核苷酸药物具体报告限或鉴定限对比表详见下表6所示。

表6. 寡核苷酸原料药质量控制

2.1.4 寡核苷酸稳定性研究

寡核苷酸药物稳定性研究的基本原则应遵循《化学药物(原料药和制剂)稳定性研究技术指导原则》的一般性要求。结合工艺开发过程中发现的药物不稳定性因素，在稳定性考察中重点关注。寡核苷酸药物稳定性研究过程中应重点考察药物稳定性相关的指标如降解杂质、高分子量杂质。

2.2 制剂研究要点

FDA审评报告中对于诺西那生钠制剂审评关注点在于:

1）具有充足的控制策略来保证无菌和微生物的控制；

2）生理相容性的pH、渗透压浓度和电解质成分；

3）寡核苷酸序列的特征鉴定、杂质分布以及杂质的控制策略；

4）具有充足的控制策略来减少制剂中的颗粒物；

5）玻璃瓶分层的风险；

6）充足的工艺验证和生产场地的质量体系。制剂处方与关键质量属性如下表所示，制剂保质期为48个月^[14]。

表7. 诺西那生钠制剂关键质量属性

2.2.1  剂型选择

目前小核酸药物的递送载体主要分为病毒性载体和非病毒类载体，非病毒类载体主要有：GalNac(N-乙酰半乳糖胺)偶联修饰、脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle,LNP)、聚合物类、外泌体、多肽偶联、抗体偶联等。10款已上市ASO均未使用特殊的递送载体，剂型均为注射液。

有些ASO也采用了递送载体，比如脂质体、GalNAc修饰、链接抗体、链接多肽、共聚体等，不过大部分产品都是处于临床研究阶段，某些递送载体在siRNA中应用的优势可能更加明显。根据研究发现，在ASO链接GalNAc能够有效地将ASO递送至肝细胞，并使活性增强10倍。

最终是否需采用递送系统还是要考虑众多因素：

①作用靶点的位置；

②注射途径;

③风险与收益的平衡。

寡核苷酸药物多具有稳定性差、易酶解、脂溶性差等特点，因此寡核苷酸药物通常选择注射途径给药。

2.2.2  辅料选择

在保证产品活性和稳定性的前提下，处方的设计和筛选应尽量选择结构简单、组分明确、质量可控、安全性风险较小的处方辅料。辅料的选择依据应充分，作用应明确，用量应合理，并有相应的研究数据支持。尽量避免选用毒性高，安全性风险大的辅料。

如使用多种来源（如动物、植物与合成来源）或多个供应商的辅料，尤其是脂质体等复杂的辅料，应按照来源和辅料变更风险分别开展相应的产品特性检定和可比性研究，以证明采用不同来源辅料所生产的产品具有等效性。

处方中若含有在人体内首次使用或在拟定给药途径中首次使用的新型辅料，应根据辅料生产相关的风险因素系统评价辅料的安全性并制定相应的质量标准。在缺乏人体安全性研究数据支持的情况下，需参照《新药用辅料非临床安全性评价指导原则》进行研究。

2.2.3 制剂质量控制

制剂的质量控制检项，应根据剂型的不同制定适宜的检项，因ASO药物常用的剂型为注射液，下表为ASO注射液常规质量控制项目，需重点关注核酸相关的有关物质控制。

表 8 反义寡核苷酸注射液质量控制

2.1.4 制剂稳定性研究

合成反义寡核苷酸药物稳定性研究的基本原则应遵循《化学药物(原料药和制剂) 稳定性研究技术指导原则》的一般性要求。结合工艺开发过程中发现的药物不稳定性因素，在稳定性考察中重点关注。合成反义寡核苷酸药物稳定性研究过程中应重点考察药物稳定性相关的指标，如pＨ、降解杂质、高聚物杂质。

  小结  

关于更多诺西那生纳药物的非临床及临床研究进展总结，请关注公众号后续文章《【技术】脊髓性肌萎缩症治疗药物-诺西那生钠调研分析（下）》。

参考文献  

[1] Mercuri E, Bertini E, Iannaccone ST. Childhood spinal muscular atrophy: controversies and challenges[J]. Lancet Neurol, 2012, 11(5): 443-452

[2] KOLB S J, KISSEL J T. Spinal muscular atrophy[ J]Neurol Clin,2015,33(4):831 -846.

[3] ARNOLD W D,KASSAR D,KISSEL J T. Spinalmuscular atrophy :diagnosis and management in a newtherapeutic era[J].Muscle Nerve, 2015,51(2 )157 -167.

[4] KOLB S I,KISSEL IT. Spinal muscular atrophy[J]Neurol Clin,2015,33(4):831 -846.

[5] KUIPER EC,BERGSMA A J.PIINAPPEL WWMP,et al. Opportunities and challenges for antisense oli.gonucleotide therapies[J].Inherit etab Dis,2021.44(1):72-87

[6] LI Q.Nusinersen as a therapeutic agent for spinalmuscular atrophy[J].Yonsei Med J,2020,61(4):273 -283.

[7] MIGLIORATI J M,LIU S,LIU A,et al. Absorption.distribution, metabolism, and excretion of FDA-approved antisense oligonucleotide drugs[J]. DrugMetab Dispos,2022,50(6):888-897

[8] 诺西那生钠EMA审评报告

[9] William F. Kiesman,Perspectives on the Designation of Oligonucleotide Starting Materials  10.1089/nat.2020.0909

[10] Comprehensive medicinal chemistry ,3rd.ed manufacturing of oligonucletides

[11] Daniel C ,Andy T ,Scott H , et al.Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Drug Products.[J].Nucleic acid therapeutics,2017,27(6):309-322.

[12] IND Submissions for Individualized Antisense Oligonucleotide Drug Products for Severely Debilitating or Life-Threatening Diseases: Chemistry, Manufacturing, and  Controls Recommendations Guidance for Sponsor-Investigators

[13] Capaldi D ,Ackley K ,Brooks D , et al.Quality Aspects of Oligonucleotide Drug Development: Specifications for Active Pharmaceutical Ingredients[J].Drug Information Journal,2012,46(5):611-626.

[14] 诺西那生钠FDA审评报告