双特异性抗体（Bispecific antibodies，BsAb），是通过细胞融合、重组DNA、蛋白质工程等技术制备的人工抗体，可以同时或先后特异性结合两种抗原或同一抗原的两个不同表位，简称双抗[2]。
一、双特异性抗体的发展
1、双特异性抗体的发展历史
1960年，在一篇Science论文中，纽约罗斯威尔公园纪念研究所的Nisonoff及其合作者首次提出了双特异性抗体的原始概念[3]。由此产生的双抗的概念和技术创新随着抗体工程和抗体生物学领域的里程碑式进程而发展（见图1）。
图1 双抗的发展时间表[4]
1975年，德国科学家Georges J.F. Köhler和英国科学家César Milstein率先开发出了杂交瘤技术，为双抗的发展奠定了基础[5]。1983年，Milstein与Cuello创造性融合两种杂交瘤细胞系，成功获得分泌双抗的四源杂交瘤细胞[6]。同年，第1个不对称的双抗出现，自此之后，双抗一直处于不断地发展过程中。直到2009年，双抗药物卡妥索单抗（Catumaxomab）问世于欧洲，它是首个正式获得批准的双抗药物，用于治疗恶性腹水，卡妥索单抗的获批具有跨时代的意义。
近年来，随着单克隆抗体技术、基因工程以及各类双抗平台的出现，双抗产品呈现出一个明显的井喷趋势，被誉为“新一代抗体药物”，双抗发展到今天已有100多种已知的结构[7]。
2、双特异性抗体的研发进展
（1）全球获批上市药物
全球获批上市的双抗药物共有14款（截至2024.02），卡妥索单抗（Catumaxomab）是第一个正式获批的双抗药物，后于2017年退市。2014年，FDA批准了全球第二款双抗药物贝林妥欧单抗（Blinatumomab）上市，靶点为CD3与CD19，用于治疗成人及儿童复发或难治性前体B细胞急性淋巴细胞白血病。从表1中药物上市时间可以看到，2020年至今，获批的双抗药物有11款，是双抗药物的一个小爆发期。截至目前全球获批的14款双抗药物针对的适应症中，肿瘤为主流适应症，其他适应症包括眼科疾病、血液疾病等。
（2）中国获批上市药物
已在中国境内获批上市的双抗药物有5个（截至2024.02），国内自主研发的有1款，是康方生物自主研发的PD-1/CTLA-4双特异性抗体新药卡度尼利单抗注射液，用于治疗既往接受含铂化疗治疗失败的复发或转移性宫颈癌患者。这是全球首款获批的基于PD-1的双特异性抗体药物，也是全球首款获批的PD-1/CTLA-4双特异性抗体。国外其他4款分别为罗氏制药的法瑞西单抗、格菲妥单抗、艾美赛珠单抗，安进公司的贝林妥欧单抗（见表1）。
表1 已获批双抗药物
（3）双抗申报适应症统计
医药魔方数据（截至2024.02）显示，双抗国内临床试验的申报适应症以肿瘤为主要适应症，包括实体瘤、非小细胞肺癌、胃癌、肝细胞癌、宫颈癌等。
图2 中国临床试验申请的双抗适应症统计
（4）双抗研发/申报靶点统计
双抗的特点是可以同时或先后特异性结合两种抗原或同一抗原的两个不同表位，因此双抗产品的研发必然伴随着靶点的选择。据医药魔方统计（截至2024.02），双抗国内临床试验的申报靶点如图3所示，排名靠前的靶点分别是PD1、CTLA4、HER2等。也有文献数据显示，临床前和临床中当前研发最热的是以CD3为核心的双抗（见图4），对于靶向不同的肿瘤抗原，图中数据显示，CD3、PD-1、PD-L1、EGFR、HER2等均为双抗产品研发的热门靶点。
图3 中国临床试验申请的双抗靶点统计
图4 全球临床前与临床的双抗靶点统计[8]
二、双特异性抗体的特点
1、双特异性抗体的结构设计类型及特点
根据不同结构可将双抗结构分为两类：不含Fc片段的双抗（非IgG样双抗）与含Fc片段的双抗（IgG样双抗），见图5。
（1）非IgG样双特异性抗体：非IgG样双抗通过片段化的分子设计，将多个抗原结合单元结合在没有Fc区域的分子上，此结构可避免链交联问题，但可能同时导致其缺乏Fc介导的相关效应功能。非IgG样双抗主要通过抗原结合的特性发挥相应的效应机制，具有清除速度更快、半衰期较短的特点。
（2）IgG样双特异性抗体：IgG样双特异性抗体是将两个不同靶点的抗原结合单元组合而成的IgG形态双抗，其具有Fc片段，可以发挥Fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用和抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用，且IgG样双抗通过Fc片段与其受体结合，半衰期相对更长。
图5 双抗的结构[4]
2、双特异性抗体作用机制
双抗靶向两种抗原或抗原表位，可以同时阻断或激活其介导的生物学功能，或使表达两种抗原的细胞相互接近从而增强两者间的相互作用，并以不同的作用机制介导多种特定的生物学效应。目前，普遍认为双抗的药效学或生物学作用机制主要包括以下类型：
（1）桥联细胞：双抗可以实现细胞毒活性效应细胞的重定向功能。双抗的一个抗原结合部位与肿瘤细胞上表达的特异性抗原结合，而另一个抗原结合部位桥联并激活效应细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞等。
（2）桥联受体：肿瘤等疾病的发生、发展往往涉及多条信号通路；复杂的生物功能也是不同信号通路共同作用的结果，因此阻断单一信号通路可能不足以完全抑制疾病的进程，反而还容易导致其他补偿通路的激活。双抗可以同时特异性阻断多条信号通路、蛋白或新生血管的生成，或通过桥联受体加强信号通路从而增强抗肿瘤效果，也可通过靶向介导增加抗肿瘤的特异性和安全性。
此外，双抗还可能通过将受体A和受体B桥联在一起，激活受体下游信号通路，将两个本不会形成二聚体的受体桥联在一起，从而产生全新的生物学信号和功能。
（3）桥联因子：双抗可以用于促进蛋白复合物和膜受体蛋白复合物的形成，提高抗体药物偶联物或激动性抗体的活性。例如，靶向凝血因子IXa和X的双特异性抗体可以通过同时桥联结合凝血因子IXa和凝血因子X，从而仿真FVⅢ的生理功能，促进凝血酶的产生。
图6 双抗的作用机制[9]
①介导免疫细胞与肿瘤细胞结合
②同时阻断多个肿瘤信号通路
③形成抗体－药物复合物
3、双特异性抗体的潜在优势
由于独特的靶点构造，双抗在治疗方面与单抗相比，可能存在以下潜在优势：
（1）介导免疫细胞对肿瘤的杀伤：介导免疫细胞杀伤是双抗的一个重要作用机制。双抗的两条抗原结合臂，其中一条与肿瘤表面靶抗原结合，另一条与免疫效应细胞上的抗原结合，通过后者激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞。
（2）增强对免疫细胞的激活：双抗的两条抗原结合臂可以同时结合两种免疫抑制受体或两种免疫激活受体，或分别与免疫抑制受体和免疫激活受体结合，从而获得比单抗更强的免疫细胞激活作用。
（3）双靶点信号阻断防止耐药：例如，HER家族属于受体酪氨酸激酶（RTKs）的一类，是肿瘤诊疗的重要靶点。肿瘤细胞可通过转换信号通路或通过HER家族成员自身或不同成员之间的同源或异源二聚体激活细胞内信号进行旁通路激活。因此采用双抗药物同时阻断两个或多个RTKs或其配体，可阻断肿瘤细胞的旁通路激活，提高治疗效果。
（4）具备更强肿瘤特异性、靶向性和降低毒性：利用双抗两种抗原结合臂可结合不同抗原的特点，从而增强抗体与肿瘤细胞的结合特异性和靶向性，降低与非肿瘤组织靶向结合后导致的不良反应。
（5）介导更强的内吞作用：双抗与细胞表面两种抗原或抗原表位的同时结合，可通过刺激受体的胞内信号，或者造成细胞膜局部流动性降低，从而激发细胞更强的内吞作用，进一步解决由于内吞不足而导致的肿瘤细胞逃逸。
三、双特异性抗体的制备
双抗的制备技术繁复多样，但从制备原理上可简单分为三类：化学偶联、构建双杂交瘤细胞系和基因工程法。
1、双特异性抗体的制备方式
（1）化学偶联法：化学偶联是最早应用于制备双特异性抗体的技术[9]。化学偶联法主要有两种方式，一是将两种单抗抗体或其衍生物直接偶联形成双特异性抗体，二是先通过各种理化方式先将两种单抗解离成游离的轻链和重链，再将这些轻链和重链重新组合。
化学偶联法的优点是可直接利用现存的抗体且产率高，快速，操作简便，回收率高；缺点是容易破坏抗体的抗原结合域，影响抗体活性，且容易形成多聚体。且使用此方法在生产过程中常需使用交联剂，故通过化学偶联法制备的双特异性抗体可能存在致癌性。因此该方法制备的双抗不能用作治疗用途，只能用于免疫学检测。由于以上缺点，目前化学偶联技术在制备双特异性抗体方面并没有得到广泛的应用。
图7 化学偶联法 [10]
（2）双杂交瘤融合法：该方法是以传统的单克隆抗体技术为基础，将分泌两种抗体的杂交瘤细胞进行融合，再对可产生具有特定治疗性抗体的融合细胞进行鉴定和分离[11]，通过这种方法可以制备能稳定分泌双抗的杂交瘤细胞。细胞融合方法包括化学方法（如：聚乙二醇）、物理方法（如：电融合）等，目前效率最高、稳定性最好的是物理电融合法。
此方法的优点是杂交瘤细胞产生的抗体生物活性好、结构稳定。缺点是制备的双特异性抗体具有较大的随机性，制备效率低，这主要是由于两种杂交瘤细胞可以产生两种不同的轻重链，而这些轻重链可以随机组合所导致的。
图8 双杂交瘤融合法[12]
（3）基因工程法：可通过将编码亲本抗体的基因克隆出来转染到宿主细胞中直接表达双抗，也可通过基因剪切，构建单链抗体（scFv)，制备改良的双抗。利用基因工程来编辑重组抗体，可以通过多种方式限制两对轻重链结合的选择性来解决随机组合的问题。例如，BiTE（双特异性T细胞接合蛋白）技术就是通过一个甘氨酸、丝氨酸连接来串联可结合T细胞的scFv和可结合肿瘤抗原的scFv，从而避免了轻重链的随机结合[13]。目前已获FDA和NMPA批准上市用于治疗白血病的贝林妥欧单抗即基于这一技术开发的。
利用化学偶联和双杂交瘤细胞系制备的双特异性抗体，其免疫原性部分多为鼠源，故免疫原性强，且不易纯化，极大限制了双特异性抗体的临床应用。而基因工程法设计的重组蛋白可以有目的地人工改变抗体结构，将鼠源部分替换为人源，大大降低了免疫原性[14]。因此，基因工程法是目前制备双特异性抗体最常用的技术。
2、双特异性抗体的制备平台
在抗体行业有一句名言：单抗看技术，双抗看平台。单抗药物的疗效在很大程度上取决于药企选择的靶点，而双抗药物的有效性则取决于药企是否拥有核心的双抗技术平台，选择适当的靶点对于单抗药物的疗效至关重要。
拥有核心的双抗技术平台可以为药企提供研发和生产双抗药物的技术支持，包括复杂的生产工艺问题和确保双抗药物的稳定性，这对于开发高效稳定的双抗药物至关重要，从而在临床应用中展现出良好的疗效。
因此，药企的双抗技术平台对双抗药物的有效性起着重大作用。目前全球正在使用的平台超过40个[15]，代表性的双抗技术平台有安进公司的BiTE平台、赛诺菲公司的Nanobody平台，罗氏公司的KiH平台、CrossMab平台，艾伯维公司的DVD-lg平台等。
表2 双抗的制备技术平台
四、双抗研发及成药难点
双抗在研发及成药方面还存在一些难点，免疫原性、低成药性、脱靶效应等问题依然制约着双抗的发展：
因双特异性抗体的分子结构在自然界中本不存在，这就大大增加了免疫原性的风险，同时降低了药物的安全性和疗效，产生抗药抗体和中和抗体，也可能导致通过形成药物ADA免疫复合物和诱发炎症的药物相关毒性反应和超敏反应。
由于双特异性抗体的结构比较复杂，成药性低。很多单抗药物开发的平台对其适用性有限，提高了开发难度，经常会遇到蛋白断裂聚集的情况，给分析方法开发造成了诸多困难。
因此双特性抗体需要高通量双特性抗体制备和筛选的平台。要想获得优质的双抗，就需要对大量的候选分子进行筛选和评估，高通量双特性抗体制备和筛选平台能够实现双抗的快速构建和批量纯化之后进行下游自动化功能验证和成药性的分析。也可进一步优化双抗的设计，双抗的合成需要不同的重链和轻链之间正确结合，过程较为复杂，不同链之间容易错配，产生无意义的组装，需要根据不同抗体的特性，对双抗设计方案进行优化和创新，提高它的正确装配率。
双抗需充分考虑脱靶效应，控制双抗在特定的部位激活，在正常组织中不发挥作用，是解决双抗脱靶效应的有效方法，可以通过筛选肿瘤的特异性靶点，利用肿瘤部位代谢产物的差异以代谢物作为调节，抗体中的特异性代谢物存在的情况下才能和抗原结合，在正常组织中无法被激活，从而降低脱靶效应。
五、小结
双抗作为新一代抗体，是药企争先想要抢占的赛道。近年来，随着DNA编辑技术的发展与进步，双抗研发逐步从理论层面走向应用层面，双抗设计丰富多样，应用领域也从肿瘤和自身免疫病发展到多领域。随着各种双抗从理论走向临床研究，可以预见，双抗必将得到进一步发展。
总之，随着众多临床研究推进以及上下游技术工艺进步，双抗规模化生产障碍将逐步得到解决，有着双结合位点的双抗有望为新型药物设计和开发提供新的发展机遇，成为未来抗体药物的主力军。
参考文献
[1]图片来自网站：https://www.chem17.com/st438237/product_34317774.html
[2]双特异性抗体抗肿瘤药物临床研发技术指导原则，国家药监局药审中心，2022.
[3] NISONOFF A,WISSLER F C,LIPMAN L N,Properties of the major component of a peptic digest of rabbit antibody.[J] .Science, 1960, 132: 1770-1.
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[10]图片来自网站：https://www.xjishu.com/zhuanli/27/201580033933.html
[11] Köhler G，Milstein，C．Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity［J］．J Immunol．，2005，174( 5) : 2453－2455．
[12] Wang Qiong,Chen Yiqun,Park Jaeyoung et al. Design and Production of Bispecific Antibodies.[J] .Antibodies (Basel), 2019, 8: undefined.
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